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基因重组水蛭素简述

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一、重组水蛭素的理化性质

1、天然水蛭素的结构

水蛭素是一种单链环肽化合物,由65个氨基酸残基组成,分子量7KD,N端有三个硫键,,分别在6~14位,16~28位和22~39位的半胱氨酸残基,使N端肽链绕迭成密集形核心环肽结构。N端的5个氨基酸残基为疏水基团,C端则为亲水基团,并游离在分子的表面。肽链中部还有一个特殊序列,不被蛋白酶所降解。素存在10种以上变异体,主要有3种变异体,简称为HVl、HV2和HV3。

2、重组水蛭素的结构

重组水蛭素除了63位Tyr残基上脱SO3-外,其他与天然水蛭素一样。

3、重组水蛭素的等电点:为3.9。

4、重组水蛭素的溶解性质

溶于水或吡啶,几乎不溶于醇、乙醚、丙酮或苯

5、重组水蛭素的稳定性

1)、水蛭素干燥状态下稳定;室温下水中可稳定存在6个月;80℃下加热15min不被破坏。

2)、pH值升高则稳定性下降,在0.1mol/L盐酸溶液或0.1m01/L氢氧化钠溶液中可稳定15min。

3)、水蛭素不被胰蛋白酶水解,对α-糜蛋白酶一定的耐受性;但番木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶A则可使之失去活性。

4)、描述了稳定的制剂处方重组水蛭素与二价金属离子(ca2+,zn2+或M矿+)形成性螯合物,在水中可稳定储存,用于静脉或皮下注射。

二、重组水蛭素的提取纯化工艺

1、发酵液经超滤、透析、离子交换层析,分离纯化目的蛋白

1.1 超滤与透析 发酵液于5000rpm冷冻离心20min,离心上清液超滤(MWCO=30000)并收集透过液,加入蒸馏水重复超滤,合并透过液。透过液超滤浓缩(MWCO=3000),加入蒸馏水重复透析除盐,最终浓缩至所需体积,置于4℃冰箱保存备用。

1.2离子交换层析 平衡缓冲液为PH3.0和PH5.0的甘氨酸缓冲液(50mmol/L),梯度洗脱缓

冲液为1/LNaCL(于50mmol/L的甘氨酸缓冲液中)。样品SP-Sepherose FF吸附并洗脱后,收集重组水蛭素活性峰,测定蛋白浓度和比活力。


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